Soutenance de thèse Rita El Khoury "Establishment of a differentiated in vitro model of non-human primate blood-brain barrier and development of a method to quantify endosomal sorting to explore cerebral drug delivery by receptor-mediated transcytosis"

J’ai le plaisir de vous inviter à ma soutenance de thèse intitulée « Establishment of a differentiated in vitro model of non-human primate blood-brain barrier and development of a method to quantify endosomal sorting to explore cerebral drug delivery by receptor-mediated transcytosis». 

Elle aura lieu le vendredi 11 juillet à 14h dans l’amphithéâtre du Neurocampus (Bâtiment 462, Hôpital Le Vinatier, 95 Boulevard Pinel, 69500 Bron). La soutenance se tiendra en anglais. Vous trouverez ci-joint un résumé de la thèse en français et en anglais.
 

Le jury sera composé de :

Pr. Mária DELI - HUN-REN Biological Research Centre (rapportrice)
Dr. Julie GUIGNOT - Université Paris Cité (rapportrice)
Dr. Giovanna LOLLO - Université Claude Bernard Lyon 1 (examinatrice)
Pr. Xavier DECLEVES - Université Paris Cité (examinateur)
Dr. Joachim CONFAIS - Cynbiose  (membre invité)
Dr. Nathalie STRAZIELLE - Université Claude Bernard Lyon 1  (directrice de thèse)
Pr. Jean-François GHERSI-EGEA - Université Claude Bernard Lyon 1  (co-directeur de thèse)

La soutenance sera suivie d’un pot qui se tiendra dans le jardin du Neurocampus. N’hésitez pas à venir au pot même si vous n’avez pas pu assister à la soutenance !

Au plaisir de vous y retrouver.

Respectueusement,

Rita El Khoury - PhD student - FLUID team

Résumé (English Bellow)
Pour assurer un microenvironnement cérébral régulé nécessaire au fonctionnement optimal du système nerveux central, deux interfaces biologiques majeures contrôlent les échanges entre le cerveau et la circulation systémique : la barrière hémato-encéphalique (BHE) située au niveau de l’endothélium cérébral et la barrière sang-liquide cérébrospinal située au niveau de l’épithélium des plexus choroïdes. Ces interfaces limitent fortement la biodisponibilité cérébrale des médicaments, compliquant le traitement de maladies neurodégénératives, neuro-inflammatoires, neuro-infectieuses et psychiatriques. Le ciblage de la transcytose médiée par récepteur (TMR) semble être une stratégie efficace pour délivrer des macromolécules au cerveau. Néanmoins, le développement de cette approche est freiné par le manque de connaissance sur le tri endosomal qui se produit dans les cellules endothéliales cérébrales (CEC) et qui oriente le vecteur thérapeutique vers le recyclage, la dégradation ou l'exocytose abluminale. Les modèles in vitro de la BHE sont utiles pour générer ces connaissances et tester les stratégies de délivrance cérébrale de médicaments macromoléculaires par TMR. Mais les modèles actuels posent des problèmes en termes de transposition à l'homme, de conservation des caractéristiques des CEC ou de reproductibilité.
L’objectif de cette thèse était de développer un modèle in vitro de BHE généré par culture primaire des CEC isolées à partir de tissu cérébral de primate non-humain (PNH), le singe
Macaca fascicularis, puis de l’utiliser pour développer une méthode robuste de quantification de la distribution de macromolécules dans les différents compartiments vésiculaire des CEC.
Nous avons développé ce modèle de BHE à partir de préparations cryopréservées d’homogénats de cortex de PNH. Le modèle a été validé par sa faible perméabilité au saccharose corrélée à la localisation péricellulaire des protéines de jonctions serrées, son niveau limité de formation de fibres de stress ainsi que par la polarité du transport dépendant du
transporteur d’efflux ABCG2. Le modèle est reproductible entre les différentes préparations cellulaires générées à partir de chaque animal.
Nous avons ensuite évalué l’expression des récepteurs impliqués dans la TMR par RT-qPCR et spectrométrie de masse. Cette étude a été menée en parallèle sur des préparations de capillaires cérébraux et des plexus choroïdes de singe et de rat, afin de déterminer les capacités de TMR respectives des deux interfaces sang-cerveau. Des différences inter-espèces ont été relevées concernant l’abondance relative des récepteurs entre les deux barrières. Ces récepteurs sont tous exprimés dans les CEC de PNH en culture, avec une abondance protéique inférieure à celle mesurée dans les capillaires isolés.
Nous avons enfin établi une méthode précise de quantification du trafic intracellulaire de macromolécules dans les CEC, basée sur une analyse de colocalisation avec les marqueurs vésiculaires des différents compartiments endosomaux par microscopie confocale. A titre de preuve de concept, nous nous sommes focalisés sur la voie de transcytose liée au récepteur de la transferrine, couramment ciblé pour l'administration de macromolécules. Nous avons suivi le devenir de son ligand endogène : l'holo-transferrine, et montré son internalisation préférentielle dans des vésicules recouvertes de clathrine et sa colocalisation principale avec les endosomes de recyclage.
Ce modèle cellulaire primate de la BHE, associé à l'analyse quantitative du tri intracellulaire, devrait s'avérer un outil précieux pour optimiser la conception de vecteurs thérapeutiques cliniquement pertinents pour permettre la délivrance cérébrale de médicaments par TMR.

Mots-clés
Culture primaire de primate non-humain, Barrière hémato-encéphalique, Transcytose médiée par récepteur, Tri endosomal.

Abstract
To ensure the regulated cerebral microenvironment required for optimal functioning of the central nervous system, two major biological interfaces control exchanges between the brain and the systemic circulation: the blood-brain barrier (BBB) located at the level of the cerebral endothelium, and the blood-cerebrospinal fluid barrier located at the level of the choroid plexus epithelium. These interfaces severely limit the cerebral bioavailability of drugs, complicating the treatment of neurodegenerative, neuroinflammatory, neuroinfectious and psychiatric diseases. Targeting receptor-mediated transcytosis (RMT) appears to be an effective strategy for delivering macromolecules to the brain. However, the development of this approach is hampered by a lack of knowledge about the endosomal sorting that occurs in brain endothelial cells (BECs) and which directs the therapeutic vector towards recycling, degradation or abluminal exocytosis. In vitro models of the BBB are useful for generating this knowledge and testing strategies for brain delivery of macromolecular drugs by RMT. But current models pose problems in terms of transposition to humans, conservation of BEC characteristics, or reproducibility.
The aim of this thesis was to develop an in vitro BBB model generated by primary culture of BECs isolated from brain tissue of a non-human primate (NHP), the monkey Macaca
fascicularis, and then to use it to develop a robust method for quantifying the distribution of macromolecules in the different vesicular compartments of BECs.
We established this BBB model from cryopreserved preparations of NHP cortices homogenates. The model was validated by its low sucrose permeability correlated with the pericellular localization of tight junction proteins, its limited level of stress fiber formation, and the polarity of ABCG2 efflux transporter-dependent transport. The model is reproducible
between cell preparations from each animal. We then assessed the expression of receptors involved in RMT by RT-qPCR and mass spectrometry. This study was carried out in parallel on monkey and rat brain capillary and choroid plexus preparations, to determine the respective RMT capacities of the two blood-brain interfaces. Interspecies differences were found in the relative abundance of receptors between the two barriers. These receptors are all expressed in cultured NHP BECs, with a protein abundance lower than those measured in isolated capillaries.
Finally, we have established a precise method for quantifying intracellular trafficking of macromolecules in BECs, based on colocalization analysis with vesicular markers of the different endosomal compartments by confocal microscopy. As a proof of concept, we focused on the transcytosis pathway linked to the transferrin receptor, commonly targeted for
macromolecule delivery. We followed the fate of its endogenous ligand, holo-transferrin, and demonstrated its preferential internalization in clathrin-coated vesicles and its primary
colocalization with recycling endosomes.
This primate cellular model of the BBB, combined with a quantitative analysis of intracellular sorting, should prove a valuable tool for optimizing the design of clinically relevant therapeutic vectors for brain drug delivery via RMT.

Key words
Non-human primate primary culture, Blood-brain barrier, Receptor-mediated transcytosis, Endosomal sorting